Сравнение российского и международных методов определения диастазного числа в натуральном меде

                                                      Е.Ю. Балашова, Е.В. Александрова, И.В. Гадалина
                                     ООО «Аналитический центр Апис», доклад на международной конференции
                                                                          «Пчеловодство – XXI век»

                                                                                Москва, май 2010г.

   Все натуральные меда, которые хранятся с соблюдением необходимых условий, содержат ферменты. Одним из важнейших является амилаза. Амилаза (или диастаза) катализирует реакции расщепления крахмала и других полисахаридов. Амилаза является ценным ферментом не столько по прису¬щим ей качествам, сколько по значению, которое она имеет для контроля каче¬ства меда. Амилаза присутствует обычно во всех медах. С количественной точки зрения она прямо связана с другими ферментами, содержащимися в меде. Так как методы определения ами¬лазы намного более доступны, чем методы определения других ферментов, по ней судят об общем количестве ферментов в меде. Помимо этого, диастаза является наиболее стойкой из всех ферментов меда, поэтому ее отсутствие или наличие в незначительных количествах указывает на нарушение условий переработки и хранения меда.
   Активность диастазы определяют по диастазному числу, которое измеряется в единицах Готе и выражается количеством кубических сантиметров 1%-ного раствора крахмала, которое разлагается при температуре 40оС за 1 час амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 грамме безводного вещества меда.
   Определение диастазного числа за рубежом относится к 1 г меда без учета содержания воды.
   1 см3 раствора крахмала соответствует 1 единице Готе.
   Величина диастазного числа зависит от многих факторов, в зависимости от сочетания которых разные меды будут содержать неодинаковое количество фермента диастазы. Диастазное число у натуральных и доброкачественных медов находится в пределах от 3 до 50.
    В РФ показатель качества меда «диастазное число» регламентируется ГОСТ 19792–2001 «Мед натуральный. Технические условия», ГОСТ Р 52451-2005 «Меды монофлорные. Технические условия», в Евросоюзе, США, Канаде и других странах Пищевым кодексом (Codex Alimentarius) [1] и Директивой Совета Европы 2001/110/ЕС [2].
   Нормируемые значения диастазного числа в России, Евросоюзе и других странах приведены в таблице 1
      Таблица 1. Нормируемые значения диастазного числа в России и Евросоюзе
                         в единицах Готе

   

ГОСТ 19792-2001*		ГОСТ Р 52451-2005*			Директива 2001/110/ЕС**		Codex Alimentarius**
все виды	Акацие-вый	Липовый	Подсол-нечнико- вый	Гречиш-ный	Все виды***	Меды, содержа- щие мало фермен- тов и HMF <= 15 мг/кг	Все виды	Меды, содержа- щие мало фермен- тов
>= 7	>= 5	>= 11	>= 15	>= 18	>= 8	>= 3	>= 8	>= 3

*      с пересчетом на безводное вещество меда
**    без пересчета на безводное вещество меда
***  кроме меда для хлебопекарной и кондитерской промышленности

   Цель работы. Изучение методов определения диастазного числа в меде и использование полученных сведений при создании ГОСТ Р на методы определения диастазного числа. Это очень актуально в настоящее время, т.к. проводится работа по стандартизации методов анализа качества меда.
   Причина возникновения этой работы. В 2009 году с целью подтверждения компетентности сотрудников ООО «Аналитический центр Апис» участвовал в международных сличительных испытаниях, которые проводит Агентство по исследованию пищевых продуктов и окружающей среды FERA (Food Environment Research Agency) из Великобритании. Был получен контрольный образец меда FAPAS® 2818F, в котором нужно было определить массовые доли воды, фруктозы, глюкозы, сахарозы, 5-гидроксиметилфурфураля (спектрофотометрическим методом и ВЭЖХ) и диастазное число. Полученные результаты были отправлены в Великобританию. После статистической обработки результатов, полученных во всех лабораториях-участниках сличительных испытаний, был опубликован отчет фирмы FERA. Результаты ООО «Аналитический центр Апис» и агентства FERA по диастазному числу приведены в таблице 2.

      Таблица 2. Результаты анализа образца меда FAPAS® 2816F, полученные в
                         ООО «Аналитический центр Апис» и по данным агентства FERA.

   

Наименование показателя	Результаты ООО «Центр Апис»	Результаты агентства FERA
		Определяемое значение	Допустимый интервал
Массовая доля воды, %	18,00	18,21	17,69 - 18,74
Массовая доля глюкозы, %	30,97	31,85	30,58 – 33,13
Массовая доля фруктозы, %	35,92	36,52	35,06 – 37,98
Массовая доля сахарозы, %	1,44	1,70	1,31 – 2,09
Массовая доля 5-гидрокси-    метилфурфураля, мг/кг    (спектрофотометрический    метод)	8,90*	8,76	4,97 – 12,54
Массовая доля 5-гидрокси-    метилфурфураля, мг/кг    (метод ВЭЖХ)	9,22	9,08	7,09 – 11,08
Диастазное число, ед. Готе	5,10**    4,18***	10,55	7,06 - 14,04

*       по методу Уайта (ГОСТ Р 52834-2007)
**     по ГОСТ 19792-2001 с пересчетом на безводное вещество меда
***   по ГОСТ 19792-2001 без пересчета на безводное вещество меда

   Анализ полученных данных показал, что все результаты ООО «Аналитический центр Апис», кроме результатов по диастазному числу, попали в интервалы допустимых значений для определяемых показателей.
   В приложении к отчету агентства FERA были указаны методы анализа, которыми пользовались участники. Одним из методов был гармонизированный метод Шейда (Schade), рекомендованный Международной комиссией по меду (IHC –International Honey Commission) [3].
   Сотрудники лаборатории освоили этот метод и сравнили его с методом, приведенным в ГОСТ 19792-2001 «Мед натуральный. Технические условия».
   Результаты исследований и их обсуждение. Основные этапы, оборудование и реагенты обоих методов схожи:
      -  спектрофотометрический метод;
      -  йодометрия;
      - реакция протекает в комбинированном реактиве, состоящем из раствора крахмала, ацетатного          буфера (рН 5,0 – 5,3) и раствора хлорида натрия.
   Основные отличия:
      – длина волны, на которой определяют величину оптической плотности, по ГОСТ 19792 - 580 нм,           по Шейду – 660 нм;
      - расчет диастазного числа по ГОСТ – на основе оптической плотности контрольного и           испытуемого растворов на безводное вещество меда, по Шейду – по графику находят время tx ,           при котором оптическая плотность раствора достигает 0,235 (рис.1), расчет проводят без учета           массовой доли воды.

         

                            

            Рис. 1. Изменение оптической плотности раствора меда при определении диастазного числа по
                        методу Шейда

      Спектры поглощения в обоих методах выглядят одинаково (рис.2).

         

                            

                  Рис. 2. Спектр поглощения раствора при определении диастазного числа в меде.

      Как известно из теории спектроскопии, для проведения точных спектроскопических измерений необходимо грамотно выбирать рабочую длину волны. В большинстве случаев удобнее всего проводить измерения в области максимального поглощения, в данном случае при длине волны 540-580 нм (близко к значениям, указанным в ГОСТ 19792). Не рекомендуется работать на крутом спаде спектральной кривой (660 нм по методу Шейда), поскольку в этом случае небольшие отклонения в значении длины волны ? приводят к заметной ошибке в определении оптической плотности, а значит, к неправильному результату.
      Следует отметить, что по мере протекания процесса разложения крахмала под действием амилазы, область максимального поглощения может смещаться с 580 до 540 нм. По графику видно, что в этом диапазоне длин волн величина оптической плотности раствора практически не изменяется и для сокращения времени анализа без существенной погрешности можно зафиксировать длину волны на 580 нм, как указано в ГОСТ 19792. В диапазоне длин волн 660 – 620 нм незначительное изменение ? приводит к существенному изменению оптической плотности, а значит, к большим различиям в качестве продукта.
     В нашем центре было проведено исследование зависимости значения диастазного числа от вида меда, метода испытаний, рабочей длины волны в каждом методе. Были выбраны 9 образцов меда: по 3 каждого вида (цветочный, гречишный, липовый) таким образом, чтобы получить полный диапазон возможных значений диастазного числа для каждого вида меда. Расчет диастазного числа по ГОСТ проводили с пересчетом на безводное вещество меда и без пересчета. Результаты анализов предствалены в таблице 3.

             Таблица 3. Значения диастазного числа для разных видов меда

   

Вид меда	Рабочая длина волны 580 нм			Рабочая длина волны 660 нм
	По ГОСТ	По ГОСТ без учета влаги	По Шейду	По ГОСТ	По ГОСТ без учета влаги	По Шейду
цветочный	4 12 28	3 10 23	5 10 24	6 17 36	5 14 30	7 14 35
гречишный	6 18 37	5 15 30	6 14 28	10 25 47	9 20 38	8 22 48
липовый	4 8 12	3 7 10	5 9 12	6 12 18	5 10 15	6 14 17

   Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что для всех видов меда наблюдаются аналогичные зависимости:
      -  независимо от метода испытаний и вида меда значения диастазного числа близки при использовании           одной и той же рабочей длины волны;
      - значения диастазного числа при измерении оптической плотности в области максимального           поглощения при длине волны 540-580 нм приблизительно в 1,5 раза меньше значения диастазного           числа, полученного при проведении измерений при 660 нм;
      -  расчет диастазного числа по ГОСТ с учетом массовой доли воды в меде делает расхождения между           результатами меньше.
   Представленные выше данные подтвердили отрицательный результат ООО «Аналитический центр Апис», полученный при международных сличительных испытаниях.
   Чтобы убедиться в том, что метод Шейда освоен верно, сотрудники ООО «Центр Апис» повторно приняли участие в международном раунде. Полученные результаты представлены в таблице 4.

      Таблица 4. Результаты анализа образца меда FAPAS® 2818F, полученные в
                        ООО «Аналитический центр Апис» и по данным агентства FERA

   

Наименование показателя	Результаты ООО «Центр Апис»	Результаты агентства FERA
		Определяемое значение	Допустимый интервал
Массовая доля воды, %	16,80	116,38	15,90 – 16,85
Массовая доля глюкозы, %	32,21	31,54	30,27 – 32,80
Массовая доля фруктозы, %	37,73	39,15	37,58 – 40,71
Массовая доля сахарозы, %	1,60	1,74	1,34 – 2,15
Массовая доля 5-гидрокси-    метилфурфураля, мг/кг    (спектрофотометрический    метод)	10,48	9,98	5,67 – 14,30
Массовая доля 5-гидрокси-    метилфурфураля, мг/кг    (метод ВЭЖХ)	9,93	8,59	6,70 – 10,48
Диастазное число, ед. Готе	9,27	9,24	6,00 – 12,47

    Получен отличный результат, диастазное число определено верно.
   В этом же образце определили диастазное число по ГОСТ 19792. Результаты приведены в таблице 5.

      Таблица 5. Диастазное число для образца меда FAPAS® 2818F, полученные по ГОСТ 19792 и методу                           Шейда

   

Рабочая длина волны 580 нм			Рабочая длина волны 660 нм
По ГОСТ	По ГОСТ без учета влаги	По Шейду	По ГОСТ	По ГОСТ без учета влаги	По Шейду
5,9	4,8	5,6	9,5	7,9	9,3

   Из результатов, приведенных в таблице 5, видно, что значения диастазного числа, полученные обоими методами при длине волны 660 нм, укладываются в допустимый интервал значений, а использование длины волны 580 нм не позволяет получить желаемый результат.
   Для подтверждения правомочности использования того или иного метода, мы решили проверить линейность обоих методов во всем диапазоне концентраций амилазы, которые встречаются в меде. Для этого при приготовлении растворов меда брали навески в 2 раза больше и в 2 раза меньше, чем написано в соответствующих методиках. Измерения проводили при длине волны в области максимума пика и при 660 нм. Полученные результаты приведены в таблицах 6 и 7 с округлением до целых единиц.

         Таблица 6. Линейность метода определения диастазного числа по Шейду.

   

Вид меда	Рабочая длина волны 540- 580 нм			Рабочая длина волны 660 нм
	Концентрация раствора меда, г/см3			Концентрация раствора меда, г/см3
	0,1	0,2	0,4	0,1	0,2	0,4
цветочный	6 13	10 24	14 30	8 18	14 35	21 47
гречишный	8 17	14 28	19 41	11 24	22 48	30 65
липовый	5 6	9 12	13 15	7 9	14 17	21 23

         Таблица 7. Линейность метода определения диастазного числа по ГОСТ 19792-2001.

   

Вид меда	Рабочая длина волны 540- 580 нм			Рабочая длина волны 660 нм
	Концентрация раствора меда, г/см3			Концентрация раствора меда, г/см3
	0,05	0,1	0,2	0,05	0,1	0,2
цветочный	6 13	12 28	25 54	9 19	17 36	34 71
гречишный	8 18	18 37	33 72	12 23	25 47	49 88
липовый	4 6	8 12	17 25	6 9	12 18	24 35

   На основании полученных данных построены зависимости диастазного числа от концентрации меда в исследуемом растворе. Построенные графики демонстрируют линейные зависимости диастазного числа от концентрации ферментов в меде при любой длине волны, когда исследования проводят по ГОСТ 19792 (рис. 3). Подтверждением правильности результатов является то, что все графики выходят из начала координат.

         

                            

      Рис. 3. Зависимость диастазного числа от концентрации ферментов в цветочном
                          меде при проведении анализа по ГОСТ 19792

        

                            

                Рис. 4. Зависимость диастазного числа от концентрации ферментов в цветочном
                           меде при проведении анализа по методу Шейда
   Результаты, полученные по методу Шейда при всех фиксированных длинах волн, плохо ложатся на прямую, кроме того, эти прямые не выходят из начала координат. Данному требованию удовлетворяют только результаты, полученные для концентраций меда не более 0,2 г/ см3.

   Эти графики позволяют сделать вывод о том, что определение диастазного числа по ГОСТ 19792 более предпочтительно во всем диапазоне определения этого показателя в меде.
   Выводы. Судя по полученным результатам, метод, описанный в ГОСТ 19792, является более предпочтительным.
   Достоинства метода определения диастазного числа по ГОСТ по сравнению с методом Шейда:
       - универсальная процедура для любого образца меда (по Шейду – индивидуальная);
       - не требуется калибровки раствора крахмала;
       - сокращенное время анализа (по Шейду – процесс длительный);
       - возможность одновременного проведения 10 анализов с учетом параллельных
         определений (по Шейду – не более 1);
       - быстрая обработка результатов расчетом по формуле (по Шейду - построение графика для каждого
         определения, нахождение времени tx, расчет результата).
   Единственным недостатком метода по ГОСТ является нестабильность диастазы в испытуемом растворе при его контакте с воздухом. Для устранения этого недостатка провели исследование стабильности испытуемых растворов в обоих методах. В методе Шейда растворы стабильны, возможно, из-за того, что готовятся в присутствии ацетатного буфера и раствора хлорида натрия. Аналогичные процедуры в нашем методе искажают результаты анализа. Для получения надежных результатов достаточно ограничить доступ воздуха к раствору или использовать свежее приготовленный раствор.
   Изучение этих методов очень актуально в настоящее время, т.к. проводится работа по стандартизации методов анализа качества меда.

Литература:

[1] Международный пищевой кодекс (Codex Alimentarius) Revised Codex Standard for Honey, CODEX STAN 12-1981, Rev.1 (1987), Rev.2 (2001)
[2] Директива Совета Европы 2001/110/ЕС от 20.12.2001 по меду (Council Directive 2001/110/EC 20.12.2001 )
[3] Harmonised Methods of the International Honey Commission (2002)

Источник

Как проверить качество мёда